Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

ПЦР-диагностика: принцип работы и возможности

Существующий чуть более 30 лет, метод диагностики инфекций с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) эволюционировал значительно и стал одним из наиболее точных и широко используемых способов выявления патогенных микроорганизмов.

Основой ПЦР является многократное увеличение концентрации фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. Этот процесс делает возможным копирование участка ДНК, который существует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

За несколько минут и несколько десятков циклов амплификации можно получить количество молекул, достаточное для дальнейшего анализа. Кроме того, с помощью ПЦР можно проводить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это делает ПЦР полезным не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Проведение ПЦР-диагностики требует специального оборудования и производится в специальных лабораториях. На сегодняшний день существует множество различных модификаций метода, включая технологии с использованием кислоты РНК. В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре и для их проведения не требуется специальное оборудование.

Популярным среди различных модификаций является "горячий старт ПЦР", который предварительно прогревает пробирки с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут для предотвращения клонирования неспецифических фрагментов ДНК.

Еще одной популярной модификацией является мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование нескольких фрагментов в одной пробирке. Это позволяет сократить время и затраты на проведение анализа и повысить точность исследования методом ПЦР.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Диагностика методом ПЦР: какие цены на проверку инфекций?

Стоимость диагностики методом ПЦР напрямую зависит от вида изучаемой инфекции, количества анализов, а также от качества и способа тестирования. Врачебные клиники устанавливают свои цены, что может привести к различиям в стоимости одного и того же анализа в разных клиниках.

За проведение диагностики одной инфекции обычно просят от 200 до 800 рублей, но стоимость может меняться в зависимости от медицинского учреждения. Кроме того, следует учитывать, что к оплате за диагностику нередко добавляется плата за взятие биоматериала, чья стоимость составляет около 400 рублей. В следующей таблице представлены приблизительные цены на некоторые виды ПЦР-анализов в Москве:

Помимо этого, многие клиники проводят комплексную диагностику, включающую сразу несколько анализов. Так, например, клиника может предложить комплексный анализ "ПЦР-8" на 8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций за 1400 рублей или "ПЦР-12" на 12 половых инфекций за 3500 рублей. Такой подход к диагностике может существенно снизить затраты на проверку на инфекции, так как при прохождении анализов по отдельности цены могут быть гораздо выше.

Фото: freepik.com